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服務目錄號：#OGF-011

服務項目：改善缺鐵性貧血功能評價

1 動物實驗

1.1 原理

用低鐵飼料喂飼動物可形成實驗性缺鐵性貧血模型，再給予受試樣品，觀察其對血液細胞學、血液生化

學等指標的影響，可判定該受試樣品對改善動物缺鐵性貧血的作用。

1.2 實驗動物

健康初斷乳大鼠，單一性別，每組大鼠8－12 只。

1.3 低鐵飼料

配方：

1.4 劑量分組及受試樣品給予時間

實驗設三個劑量組和一個低鐵對照組，以人體推薦量的5 倍為其中的一個劑量組，另設二個劑量組，必要時設陽性對照組（硫酸亞鐵或乳酸亞鐵，劑量為 2 ppm 或 2 mg/kg BW，以 Fe 元素計）。受試樣品給予時間 30天，必要時可延長至 45 天。

1.5 實驗步驟

1.5.1 建立缺鐵性貧血大鼠模型

選用健康斷乳大鼠在實驗環境下適應3－5 天后飼予低鐵飼料及去離子水（或雙蒸水），采用不銹鋼籠及食罐，同時，采用剪尾取血法放血，5 天一次，每次 0.3－0.5ml。實驗過程中避免鐵污染。自第 3 周開始每周選取部分大鼠采尾血測 Hb，如多數動物 Hb 低于 100g/L 時，測定全部大鼠的體重及 Hb。

1.5.2 恢復實驗

選取Hb<100g/L 的大鼠作為實驗動物，根據貧血大鼠 Hb 水平和體重將其隨機分為低鐵對照組和三個實驗組，各組均繼續飼予低鐵飼料，低鐵對照組給予相應溶劑，實驗組分別給予不同劑量的受試樣品，受試樣品給予時間 30 天，必要時可延長至 45 天，測定體重及各項血液學指標。

1.6 觀察指標

體重、血紅蛋白、紅細胞壓積/紅細胞內游離原卟啉。

1.6.1 血紅蛋白測定（氰化高鐵法）

消光系數法和標準曲線法任選其一測定血紅蛋白。在滿足實驗方案和儀器要求的前提下，也可采用血液分析儀測定。

1.6.1.1 吸光系數法

1.6.1.1.1 原理

血紅蛋白（haemoglobin，Hb）被鐵氰化鉀氧化后生成高鐵血紅蛋白，再與氰離子結合形成氰化高鐵血紅蛋白（紅色）， 氰化高鐵血紅蛋白（紅色）極為穩定，在 540nm 波長下，摩爾吸光系數為 44000，據此，用分光光度法測其光密度，運用吸光系數作血紅蛋白的定量測定。

1.6.1.1.2 儀器

分光光度計。

10 微升微量吸管。

1.6.1.1.3 試劑

稱取碳酸氫鈉（NaHCO3，AR）140mg、鐵氰化鉀 200mg、氰化鉀 50mg，用水溶解并稀釋到 1000mL。貯存于棕色試劑瓶內，在暗處或冰箱（4℃）保存，至少可穩定數月到 1 年。

1.6.1.1.4 實驗步驟

1.6.1.1.4.1 取試劑 2.5mL 于 5mL 帶蓋試管中，加入 10μL 血液，混勻后，放置 15 分鐘。

1.6.1.1.4.2 選用 0.5 厘米光徑比色杯，于 540nm 波長下，以試劑調零點，將所得樣品管之光密度乘以 736，

即為血紅蛋白濃度（g/L）。

計算公式如下：

Ct=待測的血紅蛋白（g/L）濃度。

= 氰化高鐵血紅蛋白在 540nm 波長下測出的光密度。

251 = 測定時血液的稀釋倍數（血 10μL 加入試劑 2.5mL 中）

44000 = 氰化高鐵血紅蛋白的摩爾吸光系數

0.5 = 比色杯的光徑

64458 = 血紅蛋白的分子量

1.6.1.1.5 注意事項

1.6.1.1.5.1 試劑不要放在聚乙烯瓶內，以免因氰離子與其反應而使試劑作用降低。

1.6.1.1.5.2 儀器因摩爾吸光系數法完全依靠儀器的吸光度來計算，故此法要求所用的儀器性能要符合要求（如儀器的波長準確與否，以及靈敏度及線性等），否則將直接影響測定的結果。

1.6.1.1.5.3 儀器在使用前最好應以 WHO 規定的氰化高鐵血紅蛋白參考液校正后再使用。參考液最好選用ICSH（國際血液學標準化委員會）確定的由 RIV（荷蘭國立公共衛生研究院）制作的氰化高鐵血紅蛋白參考液或上海醫學化驗所制備的氰化高鐵血紅蛋白標準液。

1.6.1.2 標準曲線法

1.6.1.2.1 原理

血紅蛋白（hemoglobin，Hb）在鐵氰化鉀和氰化鉀的作用下生成極為穩定的氰化高鐵血紅蛋白（紅色），其顏色深淺與血紅蛋白的含量成正比。用分光光度計在 540nm 波長下，測定血紅蛋白標準品和參考標準物質的吸光度，制成標準曲線，測得待測樣品的吸光度后查標準曲線即可得 Hb 的濃度。

1.6.1.2.2 儀器

10μL 血色素吸管（或定量毛細管）

5mL 或 10mL 帶蓋試管

分光光度計1.6.1.2.3 試劑

稱取碳酸氫鈉（NaHCO₃，AR）140mg、鐵氰化鉀 200mg、氰化鉀 50mg，用蒸餾水溶解并稀釋到 1000mL， 貯存于棕色試劑瓶內，保存于 4℃冰箱可穩定至 1 年。

1.6.1.2.4 實驗步驟

吸取2.5mL 試劑于 5mL 帶蓋試管中，用 10μL 血色素吸管（或定量毛細管）取大鼠尾血或靜脈血 10μL放置于已放入試劑的試管中；混勻放置 15min。選用 0.5cm 光徑比色杯，于 540nm 波長下，以試劑調節儀器零點，測定各樣品管的吸光度，同時測定血紅蛋白標準和參考標準物質的吸光度，繪制血紅蛋白的標準曲線。

查標準曲線可求得待測樣品和參考標準物質的血紅蛋白含量（g/L），計算參考物質的回收率。

1.6.1.2.5 注意事項

1.6.1.2.5.1 不要將試劑放在聚乙烯瓶內，以免因氰離子與其反應而使試劑作用降低。

1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系數方法計算血紅蛋白的含量，因為儀器的波長準確與否、儀器的靈敏度和線性等因素均直接影響測定結果。

1.6.1.2.5.3 每次測定時，在不同間隔反復測定血紅蛋白標準液和參考標準物質（低、中、高 3 個濃度）。

1.6.1.3 數據處理及結果判定

實驗數據可用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F 值，F 值<F0.05，結論：各組均數間差異無顯著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。

結果判定

受試樣品組與對照組比較，血紅蛋白濃度升高經統計處理差異有顯著性，且受試樣品組前后升高幅度平均達到10g/L 以上，判定該實驗結果陽性。

1.6.2 紅細胞內游離原卟啉測定

1.6.2.1 原理

血紅蛋白的合成過程中，幼紅細胞中的原卟啉在血紅素合成酶的作用下與鐵結合，當鐵供應不足時，紅細胞內的原卟啉乃以游離形式累積起來超過正常水平。因此，檢測紅細胞內游離原卟啉（Free erythrocyteproloporphyrin，FEP）的含量是檢查缺鐵性紅細胞生成的有效方法。

血液樣品經生理鹽水稀釋后，分別以乙酸乙酯：乙酸混合液（4:1）和 0.5N 鹽酸提取分離血中游離原卟啉，在一定波長下測定其原卟啉的熒光強度而定量。

1.6.2.2 儀器

1.6.2.2.1 熒光分光光度計或 930 型熒光光度計。

1.6.2.2.2 離心機。

1.6.2.2.3 混旋器。

1.6.2.3 試劑

1.6.2.3.1 肝素抗凝劑 一支 12500 單位的肝素以 0.9%生理鹽水稀釋至 25mL（1mL=500 單位）。

1.6.2.3.2 5 %（W/V）硅藻土生理鹽水懸濁液 稱取 5g 硅藻土加 0.9%生理鹽水至 100mL。

1.6.2.3.3 4:1 乙酸乙酯和乙酸混合液。

1.6.2.3.4 0.5N HCl。

1.6.2.3.5 原卟啉標準液。

1.6.2.3.5.1 原卟啉標準貯備液（50mg/L）：稱取5mg 原卟啉，加4mL 無水乙醇使之溶解，以 1.5N HCl 稀釋至100mL。

1.6.2.3.5.2 原卟啉標準中間液（1.0mg/L）：取2mL 原卟啉貯備液，以乙酸乙酯與乙酸（4:1）混合液稀釋到100mL。

1.6.2.3.5.3 原卟啉標準應用液（0.1mg/L）：取1mL 原卟啉中間液，以乙酸乙酯與乙酸（4:1）混合液稀釋到10mL。

1.6.2.4 實驗步驟

注：按上表依次加入各種試劑，在加入乙酸乙酯與乙酸混合液前，用混旋器混合已加入的混合液，然后邊混合邊加入乙酸乙酯與乙酸混合液。

離心15 分鐘，將各管上清液分別倒入 10mL 比色管中，每管加 4mL 0.5N 鹽酸，振搖 5 分鐘靜止使之分層，將上層溶劑抽出棄去，測定鹽酸液的熒光強度（30 分鐘內比色）。

1.6.2.5 熒光測量

1.6.2.5.1 若使用日立 MPF-4型熒光分光光度計測定條件為激發波長為 403nm，狹縫10nm；發射波長為 605nm，狹縫為 5nm，液槽為 1cm 厚石英槽。

1.6.2.5.2 若使用國產 930 型熒光光度計測試，條件為激發濾光片 420，熒光濾片 550，靈敏度1×500，滿度開關開至最大，液槽為 1cm 厚石英槽，檢出靈敏度為 0.01μg/4mL。在不同量原卟啉（0μg，0.01μg，0.03μg，0.05μg，0.07μg，0.1μg）呈線性關系。

1.6.2.6 計算

1.6.2.7 數據處理及結果判定

實驗數據可用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F 值，F 值<F0.05，結論：各組均數間差異無顯著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。

結果判定

受試樣品組與對照組比較，紅細胞內游離原卟啉降低經統計處理差異有顯著性，即可判定該實驗結果陽性。

1.6.2.8 注意事項

1.6.2.8.1 熒光強度隨時間延長而逐漸衰退，但 30 分鐘內基本穩定。

1.6.2.8.2 加乙酸乙酯-乙酸混合液時，一定要邊混合邊加入，否則影響測定結果。

1.6.2.9 濾紙法測定：

將滴有20 微升血點全部剪下放入試管中，同時取同樣大小空白濾紙放入標準管和空白管中，各管均加入 5%硅藻土懸濁液 0.2 亳升，振蕩后放置過夜，以下步驟同直接法。

計算：

FEP（微克/100 毫升全血）=C/B×A/D×100

A=標準管原卟啉含量（0.02 毫克）

B=標準管熒光強度-空白管熒光強度

C=血樣熒光強度-空白管熒光強度

D=取樣量

1.6.3 紅細胞壓積測定：使用全自動血細胞分析儀進行。數據處理及結果判定同“1.6.2.7”。

1.7 數據處理和結果判定

實驗數據可用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F 值，F 值<F_0.05，

結論：各組均數間差異無顯著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。

結果判定

受試樣品組與低鐵對照組相比，若血紅蛋白差異有顯著性，且其前后平均升高幅度達到10g/L 以上，同時，受試樣品紅細胞內游離原卟啉或紅細胞壓積與低鐵對照組相比差異有顯著性，可判定該受試樣品改善缺鐵性貧血動物實驗結果陽性。

1.8 注意事項

本項實驗關鍵在于貧血模型的建立。低鐵飼料含鐵量最好控制在9mg/kg 以下，所用試劑應為分析純，動物飲用水應為去離子水或雙蒸水，采用不銹鋼籠具，所用器皿應用 10%硝酸溶液處理。實驗過程中嚴防外來鐵的污染及彼此交叉污染。

2 人體試食試驗

2.1 受試者納入標準

受試者為小細胞低色素貧血，且有明確的缺鐵原因和臨床表現的成人和兒童。

2.1.1 成人納入標準：男性 Hb 80g/L－130g/L，女性 Hb 80g/L－120g/L。

2.1.2 兒童納入標準：≤6 歲兒童 Hb 70g/L－110g/L；7－18 歲青少年 80g/L－120g/L。

2.2 受試者排除標準

2.2.1 合并有心、腦血管、肝、腎、消化道等嚴重疾病及精神病患者。

2.2.2 過敏體質或對該受試樣品過敏者。

2.2.3 嚴重貧血患者。

2.2.4 短期內服用與受試功能有關的物品，影響到對結果的判斷者。

2.2.5 未按標準服用受試樣品、資料不全影響功效或安全性判斷者。

2.3 試驗設計及分組要求

采用自身和組間兩種對照設計。按受試者的血紅蛋白水平隨機分為試食組和對照組，盡可能考慮影響結果的主要因素如性別、年齡、經濟狀況等，進行均衡性檢驗，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。

2.4 受試樣品的劑量和使用方法

試食組按推薦服用方法、服用量服用受試產品，對照組可服用安慰劑或采用空白對照，也可服用具有同樣作用的陽性物。受試樣品給予時間30 天，必要時可延長至 120 天。試驗期間不改變原來的飲食習慣，正常飲食。

2.5 觀察指標

2.5.1 安全性指標

2.5.1.1 一般狀況（包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等）

2.5.1.2 血、尿、便常規檢查

2.5.1.3 肝、腎功能檢查（兒童受試者不測定此項）

2.5.1.4 腹部 B 超、胸片、心電圖檢查（各項指標在試驗前檢查一次，兒童受試者不測此項）

2.5.2 膳食調查

于試驗開始前、結束前進行三天的詢問法膳食調查，觀察飲食因素對試驗結果的影響。

2.5.3 癥狀觀察

食欲不振、乏力、煩躁、頭暈、眼花、精神不集中、心慌、氣短等。

2.5.4 功效性指標

兒童觀察指標：血紅蛋白、紅細胞內游離原卟啉

成人觀察指標：血紅蛋白、血清鐵蛋白、血清運鐵蛋白飽和度/紅細胞內游離原卟啉

2.5.4.1 血紅蛋白測定：見 1.6.1。

2.5.4.2 血清鐵蛋白測定（放射免疫法）：

2.5.4.2.1 原理

人血清中的鐵蛋白（SF）與加入的 125I 標記的 SF 競爭性地與抗鐵蛋白抗體結合。用第二抗體分離結合

部分，分別測定總放射性與沉淀物放射性計數。依據標準SF 試劑作出標準曲線，從而可在曲線上查出相應

樣品血清的SF 濃度。

2.5.4.2.2 儀器

離心機、γ-射線計數儀。

2.5.4.2.3 試劑

125I－血清鐵蛋白放射免疫分析試劑盒.。

2.5.4.2.4 操作步驟

2.5.4.2.4.1 操作步驟：鐵蛋白測定操作程序和試劑用量（mL）

（見下表）

2.5.4.2.4.2 繪制標準曲線

以各標準管的B/ B0 %作縱坐標，標準鐵蛋白濃度為橫坐標（對數邊）作標準曲線。樣品或質控由 B/ B0 %

值從曲線上查到相應的含量。

2.5.4.2.4.3 結果計算

2.5.4.2.4.4 注意事項

本實驗為抗原抗體結合反應，操作時要注意防止可引起抗原、抗體失活的因素（如高溫、冰凍等）。

測定時，要防止液體濺出，以免造成同位素污染，使本底值增高。

離心后，抽去上清液時勿將平鋪在管底的免疫復合物吸起，否則測定結果不準確。

非特異管、零管是為鑒定試劑是否符合規定而設立的。

血清鐵蛋白濃度也可用酶聯免疫吸附法測定。具體測定方法按相應試劑盒說明書進行。

2.5.4.3 血清運鐵蛋白飽和度測定

2.5.4.3.1 原理

血清中加入過量的鐵，使血清中的運鐵蛋白全部與鐵結合，達到飽和，過剩的鐵用碳酸鎂吸附除去，然后按測血清鐵的方法，測定總結合的鐵量，即為總鐵結和力。從中可計算出未飽和鐵量及血清運鐵蛋白飽和度。

2.5.4.3.2 血清鐵測定

血清鐵（SI）是指存在于血清中與血清運鐵蛋白結合的鐵，它以高鐵的形式附著在血清 pl 球蛋白的轉遞蛋白上，成人正常值為 50－184μg/100mL。缺鐵性貧血時常低于 50μg/100mL，當血紅蛋白濃度降低不明顯時，血清鐵已減少，被認為是早期缺鐵性貧血診斷依據之一。

2.5.4.3.2.1 鉻天青 B 銨鹽比色法

鉻天青B 銨鹽作為顯色劑測血清鐵，比過去多采用的聯吡啶等作為顯色劑有較高的靈敏度，其克分子吸光系數在 630nm 波長下為 1.68×10 5 L·mol -1·cm-1。可大大減少樣品血清量，方法簡便，準確。

2.5.4.3.2.1.1 原理

Fe 3／Fe 2 與鉻天青 B（CAB）和十六烷基三甲基溴化銨（CTMA）反應，形成三元膠囊狀絡合物使試劑顏色加深，其顏色加深程度與血清鐵含量成正比，在 pH 為 4.6－5.5，波長為 630nm 時，有最大吸收峰，利用檸檬酸為鐵的掩蔽劑，樣品為自身空白，不需除蛋白，即可測出血清鐵的含量。

2.5.4.3.2.1.2 試劑

2.5.4.3.2.1.2.1 緩沖溶液 pH4.75，取 25g 無水醋酸鈉，110g 氯化鈉，8mL 冰醋酸，用蒸餾水定容至 1000mL。

用酸度計測pH 應為 4.75。

2.5.4.3.2.1.2.2 顯色劑

2.5.4.3.2.1.2.2.1 0.1%鉻天青 B 銨鹽溶液（A 液）：取 0.1g 鉻天青 B 銨鹽，定容于 l00mL 蒸餾水中，放在棕色瓶中可在室溫下保存 1 個月。

2.5.4.3.2.1.2.2.2 0.3%十六烷基三甲基溴化銨（B 液）：取十六烷基三甲基溴化銨 0.3g，用蒸餾水定容至 100mL。

2.5.4.3.2.1.2.2.3 顯色劑應用液：取 90mL B 液，60mL A 液，小心混勻，用緩沖溶液定容至 1000mL，放在棕色瓶內可保存 1 個月。

2.5.4.3.2.1.2.3 掩蔽劑：稱 17.0g 檸檬酸（C6H8O7·H2O），35.0g 檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·H2O），約加 50mL蒸餾水加熱助溶，冷卻后定容至 l00mL。

2.5.4.3.2.1.2.4 鐵標準液

2.5.4.3.2.1.2.4.1 貯備液：3mmol/L，取 1.176g 硫酸亞鐵銨（6 分子結晶水）至少量蒸餾水中，加 50mL 濃硝酸混勻反應 10 分鐘，用蒸餾水定容至 1000mL。

2.5.4.3.2.1.2.4.2 工作液：30μmol/L，取 10mL 貯備液，用蒸餾水定容至 1000mL。

2.5.4.3.2.1.3 方法

按下表加入各種試劑。

標準管光密度

2.5.4.3.2.1.5 注意事項

2.5.4.3.2.1.5.1 要求所用器皿用 2N 鹽酸浸泡過夜，試劑純度為分析純以上，所用蒸餾水為雙蒸水或去離子水。

2.5.4.3.2.1.5.2 緩沖液 pH 對結果影響較大，測定時 pH 應保證在 4.70－4.80 之間。

2.5.4.3.2.1.5.3 嚴格限制波長的選擇（需經校下），血清樣品在 607－609nm 之間有一個雜質吸收峰。

2.5.4.3.2.2 原子吸收光譜法

用原子吸收光譜法測定生物樣品中微量元素的含量具有操作簡便、快速、靈敏度較高的優點，故被廣泛應用。

2.5.4.3.2.2.1 試劑

2.5.4.3.2.2.1.1 混合酸消化液：4 份硝酸，1 份高氯酸混合即成。

2.5.4.3.2.2.1.2 鐵標準溶液

2.5.4.3.2.2.1.2.1 鐵標貯備液：取 1.0000g 純金屬鐵，用鹽酸或硝酸溶解后，用 0.1N 鹽酸稀釋到 1000mL，移入聚乙烯塑料瓶內，存放在 4℃冰箱，1mL 含 1mg 鐵。

2.5.4.3.2.2.1.2.2 鐵標工作液：取 10mL 貯備液，用 0.1N 鹽酸定容至 l00mL，lmL=l00μg 鐵。

2.5.4.3.2.2.2 操作

2.5.4.3.2.2.2.1 樣品收集及處理

取靜脈血2mL 于盛有 l0mg 草酸鉀的 5mL 試管中（于每試管中加入 0.2mL5%草酸鉀，置烘箱中烤干即成），離心（3000 轉/分）15 分鐘。將分離出的血漿吸入另一帶蓋小試管中，備用。

2.5.4.3.2.2.2.2 消化

取1.0mL 血漿，于 100mL 高型燒杯中，約加 3mL 混合酸消化液，上蓋表皿，放置數小時或過夜，在沙浴電熱板上徐徐加熱煮沸，在冒白色濃煙激烈作用后溶液呈無色或淡黃色。反應終了，取下燒杯（若酸用量不夠，最后可出現溶液變黑現象，此時可再加 2 mL 混合酸消化液繼續消化直至五色）。冷卻后用 10－20mL

去離子水沖洗表皿和杯壁，除去表皿繼續加熱，直到再度冒白色濃煙，待溶液體積接近蒸干，殘留酸量不超過l mL，取下冷卻，用蒸餾水稀釋至 3mL。

2.5.4.3.2.2.2.3 測定

吸取0.0mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，5.0mL 鐵標準應用液，用 0.1N 鹽酸定容至 100mL，混合，各容量瓶中每 mL 分別相當于 0μg，0.5μg，1μg，2μg，3μg，5μg 鐵。將處理后的樣液，試劑空白，鐵標系列溶液分別導入火焰進行測定，測定條件（Pekin-Elener403 型原子吸收分光光度計）：波長 248.3nm；空心陰極燈電流：30mA，狹縫寬 0.2mm，空氣流量 13.51/min，乙炔流量：5.21/分。以鐵含量對應濃度吸光度繪制標準曲線，根據標準曲線求得樣品鐵含量。

2.5.4.3.2.2.2.4 計算

式中：X─ 血漿中鐵的含量（μg/100mL 血清）。

A1─測定用樣品液中鐵的含量（mg/L）。

A2─測定空白液中鐵的含量（mg/L）。

V─樣品處理液定容總體積（mL）。

m─ 血漿取樣量（mL）

2.5.4.3.3 總鐵結合量測定

2.5.4.3.3.1 試劑

2.5.4.3.3.1.1 鐵標準液

2.5.4.3.3.1.1.1 鉻天青 B 銨鹽法

2.5.4.3.3.1.1.1.1 貯備液：（3mmol/L）取 1.176g 硫酸亞鐵銨（6 分子結晶水）置蒸餾水中，加 50mL 濃硝酸混勻反應 10 分鐘，用蒸餾水定容至 1000mL。

2.5.4.3.3.1.1.1.2 工作液：（30μmol/L）取 10mL 貯備液，用蒸餾水定容至 1000mL。

2.5.4.3.3.1.1.2 原子吸收分光光度法

2.5.4.3.3.1.1.2.1 貯備液：取 1.0000g 純金屬鐵，用鹽酸或硝酸溶解后，用 0.1N 鹽酸稀釋到 1000mL，移入聚乙烯塑料瓶內，存放 4 oC 冰箱，1mL 含 1mg 鐵。

2.5.4.3.3.1.1.2.2 工作液：取 10mL 貯備液，用 0.1N 鹽酸定容至 100mL，1mL=100μg 鐵。

2.5.4.3.3.2 輕質碳酸鎂（AR）（或堿式碳酸鎂）其質量應符合要求。

2.5.4.3.3.3 實驗步驟

2.5.4.3.3.3.1 應用鉻天青 B 銨鹽方法測總鐵結合量

取0.1mL 血清放入尖底離心管，加 60μmol/L 鐵標準液0.1mL 充分混合，室溫放置 15 分鐘。再加 4－5mg 輕質碳酸鎂，放置 15 分鐘，混合 3－4 次。然后以 3000轉/分離心 5－8 分鐘，取上清液 0.1mL 按鉻天青 B 銨鹽比色法測血清鐵的步驟進行操作，計算。

2.5.4.3.3.3.2 原子吸收分光光度法測總鐵結合量取 1.0mL 血清，加鐵標準液（20μg/mL）0.5mL，充分混合，放置 15 分鐘。加 150mg 輕質碳酸鎂，充分混勻 1 分鐘以上，放置 30 分鐘，混合 3－4 次。離心 10 分鐘，取上清液 1mL 按原子吸收分光光度法測血清鐵的操作步驟進行消化，測定，計算。

2.5.4.3.3.4 計算

2.5.4.3.3.4.1 血清總鐵結合量可用（mg/100L）表示。

2.5.4.3.3.4.2 未飽和鐵量=血清總鐵結合量－血清鐵。

2.5.4.3.4 數據處理及結果判定

實驗數據可用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F 值，F 值<F0.05，結論：各組均數間差異無顯著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。

2.5.4.4 紅細胞內游離原卟啉：見 1.6.2。

2.5.5 結果判定

受試樣品組與對照組比較，血紅蛋白升高且平均升高幅度≥10g/L，血清鐵蛋白增加，血清運鐵蛋白飽和度升高，紅細胞游離原卟啉降低，經統計處理差異有顯著性，即可分別判定該指標結果陽性。

2.6 數據處理及結果判定

試驗數據為計量資料，可用t 檢驗進行分析。凡自身對照資料可以采用配對 t 檢驗，兩組均數比較采用成組 t 檢驗，后者需進行方差齊性檢驗，對非正態分布或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態方差齊后，用轉換的數據進行 t 檢驗；若轉換數據仍不能滿足正態方差齊要求，改用 t＇檢驗或秩和檢驗；但變異系數太大（如 CV>50%）的資料應用秩和檢驗。

結果判定

改善兒童缺鐵性貧血：試驗前后自身比較和試驗后組間比較，血紅蛋白、紅細胞內游離原卟啉二項指標差異有顯著性；同時，試食組自身前后比較，血紅蛋白平均升高幅度≥10g/L，可判定受試樣品具有改善缺鐵性貧血的作用。

改善成人缺鐵性貧血：試驗前后自身比較和試驗后組間比較，血紅蛋白指標差異有顯著性；同時，試食組自身前后比較，血紅蛋白平均升高幅度≥10g/L，血清鐵蛋白、紅細胞內游離原卟啉/血清運鐵蛋白飽和度二項指標中一項指標陽性，可判定該受試樣品具有改善缺鐵性貧血的作用。